食物中胆固醇的测定方法主要有气相色谱法和比色法。色谱法必须具备气相色谱仪，此仪器价格昂贵，故在国内不易普及，因此选用经济、简便、实用的比色法进行食物中胆固醇的测定。

比色法

1.原理

固醇类化合物与酸试剂作用，可脱水，发生聚合反应并产生强的颜色反应。

2.适用范围

此方法适用于动物性食物中胆固醇的测定。

3.仪器

(1)实验室常用设备

(2)分光光度计

(3)电热恒温水浴

4.试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，均为蒸馏水。

(1)石油醚

(2)无水乙醇

(3)浓硫酸

(4)冰乙酸(优级纯)

(5)磷酸

(6)胆固醇标准(美国Sigma公司)

标准储备液：准确称取胆固醇100mg，(胆固醇标准开启后放在干燥器内)溶于冰乙酸中，并定溶至100ml。其浓度为1g/L。可保存2个月。

标准工作液：取标准储备液10ml，用冰乙酸定溶至100ml。其浓度为0.1g/L。此液用时临时配制。

(7)铁矾显色液：

储备液：溶解4.463克硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O]于100ml85%磷酸中贮于干燥器内，此溶液在室温中稳定。

*铁矾储备液须在实验前两周配制，因硫酸铁铵不易溶解，每天要进行短时间的振摇待溶质完全溶于磷酸后再定溶到体积。

工作液：吸取储备液10ml用浓硫酸稀释到100ml。贮于干燥器内。

(8)氢氧化钾50%溶液：溶解50g氢氧化钾于水中，定溶至100ml。

(9)氯化钠5%溶液：溶解5克氯化钠于水中，定溶至100ml。

(10)纯氮(99.99%)

5.操作步骤

5.1样品脂肪的提取与测定：根据食物种类分别用索氏提取法、研磨法和罗高氏法提取脂肪，并计算出每100克食物中脂肪含量。

5.2样品胆固醇的测定：准确称取提取的油脂3-4滴(约含胆固醇300-500&m;g)取样量可按样品中胆固醇的浓度增减。置于25ml试管内，加入4ml无水乙醇，0.5ml50%氢氧化钾，在65℃恒温水浴中皂化1小时。皂化时每隔20-30分钟振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3ml5%氯化钠、10ml石油醚，盖紧玻璃塞，振摇2分钟，静置分层(一般需1小时以上)。

取上层石油醚2ml，置于10ml具玻璃塞的试管内，在65℃恒温水浴中用氮气吹干，加入4ml冰乙酸，2ml铁矾显色液，混匀，放置15分钟后560-575nm下比色。

5.3标准曲线：准确吸取胆固醇工作液0;0.5;1.0;1.5;2.0ml分别置于10ml试管内，在各管内加入冰乙酸，使总体积达4ml。沿管壁加2ml铁矾显色液，混匀，在15-90分钟内，560-575nm下比色。

6.分析结果

样品中胆固醇含量(mg/100g)=C×V/V×1/W×F/1000

式中

C=测得的光密度值在胆固醇标准曲线上显示的胆固醇量(&m;g)

V=石油醚总体积(ml)

V=取出的石油醚体积(ml)

W=称取油脂重量(g)

F=样品的脂肪含量(g/100g)

1/1000=折算成每100克食物中胆固醇的毫克数。

7.注意事项

同一实验室同时或连续两次测定结果之差不得超过平均值的10%。